Строение бактерий много проще и однообразнее, чем строение простейших, и здесь нет такого богатства форм, как у инфузорий. Однако это единообразие и простота строения делают бактерии очень хорошей моделью для многих опытов. Еще проще устроены, и поэтому еще лучше, как модель, вирусы. Но о них - после, в особой главе.
Чтобы посмотреть на живые бактерии, нам с вами придется поискать более сильные и сложные микроскопы, чем те, в которые можно рассмотреть инфузории. Без увеличения в 600-800 раз тут не обойтись.
Зато источник, в котором всегда можно найти множество разнообразных бактерий, доступен всегда. Это - ваш собственный рот. Соскребите зубной налет и размешайте его в капельке воды или слюны на предметном стекле. Этого вам хватит для ознакомления с основными формами бактерий.
Если вы посмотрите на них в обычный микроскоп, употребляющийся в медицинских и биологических лабораториях, то, наверное, разочаруетесь. Будут видны сероватые, с нечеткими контурами, очень маленькие палочки, шарики, нити. Разве их сравнить с причудливыми, как тропические рыбы, инфузориями?
В так называемый фазово-контрастный микроскоп вы сможете увидеть больше. Отличие этого микроскопа от обычного сводится к тому, что частицы, одинаково прозрачные для световых лучей, но с разной плотностью выглядят здесь по-разному: более плотные - темнее, менее плотные - светлее.
Интересно наблюдать живых бактерий в так называемый темнопольный микроскоп. Лучи света здесь идут не через объект наблюдения в объектив микроскопа, а сбоку. Вы, наверное, видели, как ярко светятся пылинки в солнечном луче, пробившемся из-за штор или ставни в темной комнате.
Примерно так же выглядят в темнопольном микроскопе и бактерии - как светлые точки на угольно-черном или коричневатом фоне. Общие очертания их при этом немного смазываются, но зато хорошо видно движение бактерий. А характер движения позволяет распознавать возбудителей некоторых болезней.
Фото: U.S. Geological Survey
Фото: Umberto Salvagnin
Иные бактерии не имеют жгутиков, нужных для передвижения. Но это не значит, что в поле зрения микроскопа они будут неподвижны. Нет, вам покажется, что бактерии движутся, причем все разом, как муравьи в развороченном муравейнике. Однако это - не самостоятельное, активное движение микроба, а так называемое броуновское движение.
Броуновское движение любых мелких частиц, плавающих в жидкости (отнюдь не только микробов), - следствие беспорядочного теплового движения молекул этой жидкости. Молекулы давят на частицу со всех сторон, и она, так сказать, «топчется на месте».
Зато если под микроскопом подвижные бактерии, то вы увидите, как быстро они пересекают поле зрения, замирают на месте, а затем снова устремляются дальше. Особенно интересно наблюдать за спирохетами, похожими на ожившую спираль от электрической плитки. Они настолько тонки, что под обычным микроскопом живую спирохету трудно разглядеть.
В темнопольном микроскопе они видны гораздо лучше. Вы, наверное, найдете их в зубном налете; только хорошенько приглядитесь - лучше всего искать спирохет во время их движения. Они или плывут, извиваясь, как змейки, или дергаются на месте и даже складываются пополам.
Живых бактерий рассматривать в микроскоп не столь удобно, как мертвых и окрашенных.
С каким увеличением желательно приобрести микроскоп, чтобы увидеть в АКЧ микроорганизмы?
Детали строения этих организмов были изучены именно на окрашенных препаратах. Чтобы окрасить бактерии, нужно нанести их на стекло (как говорят, сделать мазок), высушить его, прогреть на пламени горелки (чтобы клетки впоследствии лучше подкрасились) и капнуть на мазок каплю специальной краски.
Если вы попадете в микробиологическую лабораторию, то там, конечно, найдется набор разнообразных красок. Одна из самых распространенных - метиленовая синяя. Так как она входит в состав чернил для авторучки, то за неимением лучшего можно брызнуть на мазок каплю чернил. Через 6-8 минут краску надо смыть водой и высушить мазок.
В зависимости от того, какой вид бактерий был окрашен, вы увидите под микроскопом шарики или палочки - прямые, изогнутые или похожие на запятую. Из палочек и шариков могут образовываться цепочки. Шарики иногда объединены в группы по четыре, восемь и шестнадцать. У некоторых палочек на концах есть утолщения вроде спичечной головки. Таковы основные формы бактерий.
Однако столь краткое описание напоминает слова одного философа, который определил человека как двуногое без перьев. У бактерий, даже окрашенных самым простым способом, можно найти довольно много особенностей их строения. О некоторых из этих особенностей мы здесь расскажем.
Палочковидных бактерий в природе больше всего. Само слово «бактерия» по-гречески значит «палочка». Один из самых распространенных микробов, так называемая кишечная палочка, имеет форму длинного овала. Кишечная палочка обитает в толстых кишках; в одном грамме человеческих испражнений может содержаться 2-Ъ миллиарда этих микроорганизмов (представляете, сколько их попадает во внешнюю среду в населенной местности!).
По форме от кишечной палочки неотличимы и болезнетворные микробы - возбудители дизентерии, тифа, паратифа. Возбудитель сибирской язвы - тоже палочка, но с обрубленными концами. Бактерии сибирской язвы часто располагаются в виде длинных нитей-цепочек.
Форму палочки имеют возбудители столбняка, газовой гангрены и многих других болезней.
Иногда можно встретить название «холерная запятая». Действительно, так называемые вибрионы похожи на запятую. К ним относится и возбудитель холеры. Только не представляйте себе холерную запятую в виде головастика, как любил ее рисовать в «Окнах РОСТА» Маяковский. Это скорее изогнутая палочка равномерной толщины. Строго говоря, это даже не палочка, а отрезок спирали, один ее неполный виток.
Шаровидные бактерии называются кокками. Кокки, собранные в гроздья, напоминающие виноградные, носят название стафилококков. Некоторые из них, попадая в ранки или царапины, служат причиной нагноений и вызывают тяжелые заболевания у детей раннего возраста.
Много несчастий причиняют человеку стрептококки - микробы, похожие на нитки бус или четки. Они вызывают и рожистое воспаление, и ангину, и даже заболевание сердца - эндокардит. Коккам, расположенным по два - диплококкам, - человек обязан такими болезнями, как менингит, воспаление легких, гонорея.
В окрашенном мазке легко определить форму бактерий, но изучить строение бактериальной клетки во всех деталях невозможно. И если мы все-таки уже много знаем о строении бактерий, то этому помогли специальные методы их окраски и изучение их под электронным микроскопом.
- микроскопический метод: световая, фазово-контрастная, флуоресцентная, электронная;
- культуральный метод (бактериологический, вирусологический);
- биологический метод (заражение лабораторных животных);
- молекулярно-генетический метод (ПЦР — полимеразная цепная реакция)
- серологический метод — выявления антигенов микроорганизмов или антител к ним;
Способы приготовления препаратов для микроскопии. При помощи светового микроскопа можно изучать микроорганизмы, как в живом, так и в окрашенном состоянии. При исследовании микробов в живом состоянии можно получить представление о размерах, форме и характере их движения. Иногда внутри живой клетки видны блестящие, сильно преломляющие свет гранулы и споры. Для изучения микробов в живом состоянии готовят препараты висячей и раздавленной капли. Для приготовления препарата висячей капли (рис. 19) бактериологической петлей в центр покровного стекла наносят небольшую каплю исследуемого материала, суспендированного в жидкости (изотонический раствор хлорида натрия, мясопептонный бульон). Затем берут специальное стекло с луночкой в центре и края ее смазывают вазелиновым маслом. Луночкой предметного стекла накрывают каплю исследуемого материала на покровном стекле так, чтобы капля находилась в центре луночки. Слегка прижимают предметное стекло и быстро переворачивают. При правильном приготовлении препарата капля свисает в луночку. Вазелиновое масло предохраняет ее от высыхания.
Препарат раздавленной капли готовят нанесением капли суспендированного в жидкости материала на предметное стекло, которое затем накрывают покровным.
СВЕТООПТИЧЕСКАЯ МИКРОСКОПИЯ
Для световой микроскопии применяют микроскоп - оптический прибор, позволяющий наблюдать мелкие объекты. Увеличение изображения достигают системой линз конденсора, объектива и окуляра. Конденсор, расположенный между источником света и изучаемым объектом, собирает лучи света в поле микроскопа. Объектив создаёт изображение поля микроскопа внутри тубуса. Окуляр увеличивает это изображение и делает возможным его восприятие глазом.
Микроскопия в домашних условиях
Предел разрешения микроскопа (минимальное расстояние, на котором различимы два объекта) определяется длиной световой волны и апертурой линз. Теоретически возможный предел разрешения светового микроскопа равен 0,2 мкм; реальное разрешение можно повысить за счёт увеличения апертуры оптической системы, например путём увеличения коэффициента преломления. Коэффициент преломления (иммерсии) жидких сред больше коэффициента преломления воздуха («=1,0), при микроскопировании применяют несколько иммерсионных сред: масляную, глицериновую, водную. Механическая часть микроскопа включает штатив, предметный столик, макро- и микрометрический винты, тубус, тубусодержатель.
Темнопольная микроскопия позволяет наблюдать живые бактерии. Для этого используют темнопольный конденсор, выделяющий контрастирующие структуры неокрашенного материала. Перед началом работы свет устанавливают и центрируют по светлому полю, затем светлопольный конденсор удаляют и заменяют соответствующей системой (например, ОИ-10 или ОИ-21). Препарат готовят по методу «раздавленной капли», делая его как можно более тонким (толщина покровного стекла не должна быть толще 1 мм). Наблюдаемый объект выглядит как освещенный на тёмном поле. При этом лучи от осветителя падают на объект сбоку, а в линзы микроскопа поступают только рассеянные лучи. В качестве иммерсионной жидкости пригодно вазелиновое масло.
Фазово-контрастная микроскопия позволяет изучать живые и неокрашенные объекты за счёт повышения их контрастности. При прохождении света через окрашенные объекты происходит изменение амплитуды световой волны, а при прохождении через неокрашенные - фазы световой волны, что используют для получения высококонтрастного изображения в фазово-контрастной и интерференционной микроскопии. Для повышения контрастности фазовые кольца покрывают металлом, поглощающим прямой свет, не влияя на сдвиг фазы. В оптической системе микроскопа применяют специальный конденсор с револьвером диафрагм и центрирующим устройством; объективы заменяют на иммерсионные объективы-апохроматы.
Поляризационная микроскопия позволяет получать изображения неокрашенных анизотропных структур (например, коллагеновых волокон, миофибрилл или клеток микроорганизмов). Принцип метода основан на изучении объекта в свете, образованном двумя лучами, поляризованными во взаимно перпендикулярных плоскостях.
Интерференционная микроскопия объединяет принципы фазово-контрастной и поляризационной микроскопии. Метод применяют для получения контрастного трёхмерного изображения неокрашенных объектов. Принцип метода основан на раздвоении светового потока в микроскопе; один луч проходит через объект, другой - мимо него. Оба луча соединяются в окуляре и интерферируют между собой.
Люминесцентная микроскопия. Метод основан на способности некоторых веществ светиться при воздействии коротковолнового излучения. При этом испускаемые световые волны длиннее волны, вызывающей свечение. Иными словами, флюоресцирующие объекты поглощают свет одной длины волны и излучают в другой области спектра. Например, если индуцирующее излучение синее, то образующееся свечение может быть красным или жёлтым. Эти вещества (флюоресцеин изоцианат, акридиновый оранжевый, родамин и др.) используют как флюоресцирующие красители для наблюдения флюоресцирующих (люминесцирующих) объектов. В люминесцентном микроскопе свет от источника (ртутная лампа сверхвысокого давления) проходит через два фильтра. Первый (синий) фильтр задерживает свет перед образцом и пропускает свет длины волны, возбуждающей флюоресценцию образца. Второй (жёлтый) задерживает синий свет, но пропускает жёлтый, красный, зелёный свет, излучаемый флюоресцирующим объектом и воспринимаемый глазом. Обычно исследуемые микроорганизмы окрашивают непосредственно либо с помощью AT или лектинов, помеченных флюорохромами. Препараты взаимодействуют с Аг или другими связывающими лиганд структурами объекта. Люминесцентная микроскопия нашла широкое применение для визуализации результатов иммунохимических реакций, основанных на специфическом взаимодействии меченных флюоресцирующими красителями AT с Аг изучаемого объекта.
